Gaz Kromatografisi Kütle Spektroskopisi

Gaz Kromatografisi – Kütle Spektroskopisi

Gaz kromatografisi – kütle spektroskopisi (GC-MS) iki mikro analitiksel tekniğin birleşimidir; GC bir arama yöntemidir ve MS bir tanımlama tekniğidir. Bu kombinasyon birçok avantaj sağlar. İlk olarak kompleks bir karışımdaki bileşenleri birbirinden ayırır. Şöyle ki, her bileşiğin nitel analizi için kütlelerin bulunmasında, ikinci olarak ise aynı bileşik içerisindeki kütlelerin miktarları üzerine bilgi edinmemizi sağlar. 1 pmol analitten (moleküler ağırlık karakteristiksel parçalar yada kimyasal parmak izleri gibi tanımlama işlemi için esas olarak kullanılan maddeler) daha azı kullanılarak GC-MS yöntemiyle tam bir kütle ayrışımı sağlanır.

GC-MS kombinasyonu; her bir tekniğin tek başına uygulanması nedeniyle kesin olarak karşılaşılan eksikliklerin yada sınırlandırılmışlığın üstesinden gelir. Örneğin; saf olmayan (katışık) bir maddeyi analiz etmek için yalnızca MS yöntemi kullanılırsa, ilave edilmiş kütle ayrışımı ile iki yada daha fazla bileşik bulunabilir. Sonuç eğer tercüme edilemez değilse bile şaşırtıcı olabilir. Diğer yandan, katışık bir maddenin GC-MS ile analizi halinde analitteki saflığı bozan bileşenler ayrılır ve her bir bileşenin kütle spektrumu bulunur. Sadece GC’ nin kullanımı da şüpheli sonuçlara yol açabilir. Hatırlatma indeksindeki çeşitli bileşen örneklerinin tanımlanmasına dayanılarak yapıldığı için bazı belirsizlikler vardır.

GC’ ye Giriş
GC analizinin bir özeti Şekil 1’ de gösterilmiştir. Örnek diyagramın sol tarafında gösterilmiştir. Bu karışımda A ve B maddesi X çözücüsüyle çözünmüştür. Örnek solüsyon gaz kromatografına enjekte edildiğinde buharlaşır. Hareketli faz buhar kolon boyunca taşınır ve bölmelere ayrılır. Hareketli faz organik sabit faz başlayana kadar devam eder. Hareketli faz boyunca tesirsiz gaz örnekteki bileşenleri kolon boyunca hareket ettirir. X çözücüsü sabit fazla çok az etkileşimdedir ve kolondan çıkan ilk bileşendir. A ve B çözünenleri X çözücüsü gibi sütunun içinden geçerek hareket eder. B sabit fazla A’ dan daha fazla etkileşim halindedir. Böylece B kolonda A’ dan daha uzun süre tutulur. Sonuç itibarıyla A kolonda B’ den önce ortaya çıkar ve A’ nın tutulma zamanı B’ den daha kısadır. Sütunun sonundaki detektörler (algılayıcılar) elektriksel tepki üretirler. Taşıyıcı gaz eklendiğinde organik madde onun içinden geçer. Detektör tepkilerinin zamana göre kaydı sonucu bir kromatogram oluşur (Şekil 1.3). GC-MS kullanıldığı taktirde kütle spektrometresindeki iyon kaynağından saf bileşenler kolonda ayrılır.

Şekil 1. Gaz kromatografının kavramsal operasyonel özellikleri alaşım B – A’ ya göre durgunluk aşaması ile daha fazla etkileşir. Bu yüzden B’ nin saklama zamanı A’ ya göre daha uzundur.

Şekil 2’ de tipik bir gaz kromatografisinin özellikleri gösterilmektedir. Tutulamayan bileşikler için zaman gereklidir (yukarıda sözü geçen çözücü) ve o bileşik kolondan geçerken, t0; t0 kolonun hacmiyle orantılıdır. Tutulma zamanı, tRA, A’ nın kolondan geçerken harcadığı süredir. Düzenlenmiş tutulma zamanı, tıRA, tRA ve t0 arasındaki farktır (tıRA = tRA – t0) ve A maddesi ile sabit faz arasındaki etkileşim miktarının belirtisidir.

Gaz kromatografındaki dikey eksen detektörün tepkilerini simgeler. Bu tepkinin büyüklüğü bulunan maddenin miktarıyla orantılıdır. Yatay eksen ise tutulma zamanını gösterir ki verilen bileşiğin niteliksel özelliklerini bulmada kullanılabilir.

Şekil 2. Gaz kromatogram formatı, GC’ deki data kaydı.

Modern GC-MS metodunda çok ince bir tüp gibi kolonlar kullanılır ve bunlar açık tüpsü kolonlar diye adlandırılır. Bu tip kolonlar çok dar çaplı (100 – 750 µm) camdan, erimiş silika, tesirsiz metal (örnek; nikel) yada Silicasteel®’ den yapılır. Bu tüpler çeşitli boylarda olabilir (2 – 60 m yada daha fazla). Kolonların etrafı kaynama noktası yüksek bir sıvıyla kaplanır. Bu da sabit faza yardımcı olur. Unutulmaması gereken çok önemli bir hususta kolon sıcaklığındaki değişimin hiçbir zaman sabit fazdaki sıvının katıya dönüşmesine izin verecek kadar düşmemesi gerektiğidir. Sabit faz genellikle bir organosiloksan polimeridir. Dolayısıyla birçok metil grubu fonksiyonel gruplara karışır ve sabit faza çeşitli tipteki bileşikleri ayırma özelliği sağlar.

İç çapları 320 µm yada daha az olan kolonlar da en uygun akış oranı dakikada 2 mL yada daha azdır. Bu kolonlar direkt olarak kütle spektroskopisinin içine sokulur. Geniş çaplı kolonlar (530 µm ve 750 µm) 2 mL/dk’ dan daha yüksek akış oranına sahiptir ve iki cisim arasındaki ortak yüzey aracı bulundurmalılar. Gözenekli tabakalı açık tüplü (PLOT) kolonların polimerik materyalli fiberleri vardır. Al₂O₃ yada duvarlarında moleküler elek bağları vardır. Bunlar özel karışımları ayırmak için kullanılır. Örneğin; moleküler elekli PLOT kolonların kullanımı sürekli aynı kolon gazların (O₂, N₂, CO, H₂O gibi) ayrıştırılmasında kullanılır.

Sarmalanmış kolonlar 3 mm ve 6 mm’ lik iç çapa sahiptirler. Bazen 12 mm kadar geniş olabilirler. Uzunluğu 1 m ile 3 m arasında değişir. Bazen 15 m’ ye kadar çıkabilir. Katı bir desteğin üzerine tüplüklü kolonların dış yapısında kullanılan sabit faz kaynama noktası yüksek sıvılarla katı destek (örnek; diatomaceos earth) kaplanır. Toplam ağırlığın % 1 – 10’ u genellikle likit kısımdan oluşur. Daha sonra bu katı madde kolonun içine paketlenir ve kolonun sabit fazı başlar.

Açık tüplü kolonlar ve destek kaplı açık tüplü (SCOT) kolonlar birbirine benzer. SCOT kolonlar sabit fazın “whiskers” halindeyken destek geçici olarak kolonların dış yüzeyinden çekilir. Kolonun ortası açılır. Uygun kolon performansı, taşıyıcı gazın akış oranına, kolonun çapına ve sabit fazın tabakasının kalınlığına bağlıdır. Kromatografik kolonun randımanı yüksek ekivalent teorik tabakası (HETP) terimleriyle adlandırılır. Bu da kolon uzunluğunca sabit fazla hareketli faz arasında analitlerin parçalanması, ayrılmasındaki eşitliğin başarılması demektir. Kısa segmentli (HETP) kolonlar bu eşitliği sağlamakta daha fazla randımana sahiptirler. Tipik bir taşıyıcı gaz akış oranı fonksiyonuna sahip olan HETP grafiği Şekil 3’ te gösterilmiştir. He ve H₂ haricinde gaz kromatografi kolonunun işlemesinde randımanı yüksek olan başka maddeler de vardır. Fakat bunların (He, H₂) GC-MS vakum sisteminde pompalanması daha kolaydır.

Şekil 3. HETP ile GC’ deki taşıyıcı akış oranı arasındaki van Deemter ilişkisinin tipik alanları.

GC-MS metodunda kolon, kolon performansının değişmesine sebep olan bir vakum kaynağı ile birleştirilmiş olup 1 atm basınç altında çalışan FID gibi GC detektörüne benzer bir kullanımı vardır. Kolonun çıkış ucundaki vakumun etkisiyle tutulma zamanı değişir ve kromatografik pikin en genişliği artar.

Sık sık bileşiklerin % 10’ luk yada daha az payları yada karışımdaki maddelerin bir kısmı izolasyon yada pürifikasyon prosedürlerinden (örnek; sıvı-sıvı yada katı-sıvı yada ikisi de) daha uzun ömürlü olabilir. Yeterli bir pürifikasyon (ön arıtma) ve dirayvatizasyon (kökenine inme)’ dan sonra GC son arıtma evresi olarak bir çok bileşenin eriyerek kütle spektrometresindeki analizlerde zamanında ve teker teker görünmesini sağlar. Kromatografi ve kütle spektrometresinin bir özelliği de farklı basınçlarda çalışabilir olmak olsa da yeterli derecede buharlaşabilen maddeler buhar fazı analitiksel GC teknikleriyle analiz edilebilir. Bunun yanında elektron çarpışma iyonizasyonu (EI) yada kimyasal iyonizasyon (CI) MS analizleri yapılması uygundur. Bundan başka madde miktarı iki araç tarafından da yaklaşık olarak aynı oranda kullanılır. GC girişi belki de kütle spektrometresinin duyarlılığının en uygun ve randımanlı şekilde çalışmasını sağlar.

1. Ana enjeksiyon tipleri

GC-MS metodundaki içeri alma sistemi çok önemlidir ve bu enjeksiyon bölümü olarak adlandırılır. Tamamlanmış GC-MS sisteminin sık sık gözden geçirilmesi ve bu sistemin kullanımının yorumlanması ve tanımı önemlidir. Kapiler GC metodundaki enjeksiyon teknikleri yanlış kullanıldığında çarpıcı olarak sonuçları nitel ve nicel oranlarda etkileyebilir.

Kapiler GC kolonlarına maddeyi sokmak için kullanılan parçalı enjeksiyon klasik bir yaklaşımdır. Sıvı maddeler ısıtılmış bir cam tüp içinde buharlaştırılır. Çözücü ve çözünen maddelerin buharı birleşmiş bir şekilde kapiler kolonun içine girer. Buharlaştırılmış enjeksiyonda ekseriyetle maddeler (buhar) enjektörden kolondaki parçalı deliğe akar. Eriyen maddenin parçalı banda ilk yerleştirilmesinin sağlanmasında parçalı enjeksiyon tekniği kusursuz bir araçtır ve küçük maddeleri içeri almak için çok etkili bir yoldur. Fakat 0.1 – 1 µL hacimli şırıngalarla elle uygulamak hiç de güvenilir değildir. Parçaların oran dizilimleri 20:1’ den 500:1’ e kadar yükselebilir. Parçalı enjeksiyon kullanılırken analit konsantrasyonu yüksek tutulmalıdır; bu yüksek duyarlılıkta bir teknik değildir.

Parçasız enjeksiyon ise maddenin hepsinin yada en azından büyük çoğunluğunun kolona aktarıldığı bir araçtır. Genellikle GC enjektörleri hem parçalı hem de parçasız operasyonlara uygun olarak dizayn edilmiştir. Parçasız operasyonu boyunca çıkış kapağı tutulur. Dolayısıyla buharlaştırılmış maddeler taşıyıcı fazında enjeksiyon hacminde büyük bir alan kaplamasıyla birlikte kolonun üzerine bir güç uygular. Bu metotta gerilimin artması saniyeler alabilir. Bu prosesin sonlarına doğru parçalı buharlaşma kuvvetinin düzenlenmesi için % 90 yada daha fazla örnek materyal içeriye girdikten sonra tekrar açılır. Bu parçasız enjeksiyon yöntemi oldukça düşük konsantrasyonda analite ihtiyaç duyar.

Kolon üzeri (on-column) enjeksiyon yöntemi ise tüm solüsyon şırıngadan direkt kolonun girişine yada kolon öncesindeki kaplanmamış bölgeye koyulur. Bu yöntem boyunca taşıyıcı gaz şırıngadan gelen sıvıyı tüp duvar üzerindeki tabakaya (filme) tekrar dağıtır. Bu şekilde olan enjeksiyon GC kolonları için en güvenilir ve tekrarlanabilir madde enjekte yöntemidir. Kolondaki sıvı maddenin yüzeyindeki bölümden çözünen maddenin buharının oluştuğu gerçeği tekrarlanabilirliği kanıtlar. Hem parçalı hem de parçasız kolon enjeksiyonu yapılabilir, uygulanabilir. Genellikle kolon üzeri enjeksiyonu soğuk enjektörle yapılır. Enjektörün sıcaklığı ilk buharlaşan çözücüye göre programlanır. Sonrakiler analitlerin buharlaşmasına göre. Soğuk parçalı enjeksiyon modelinde madde 100 µL’ den daha fazla temin edilebilir. Bundan dolayı detekte limiti oldukça düşüktür.

2. Enjeksiyon hususları ve şırınga yönetimi
Enjeksiyon yapılması gerekliliği konusunda pek çok düşünce vardır. En güvenilir yol aynı hacmi tekrar tekrar sağlayabilen bir yöntem olan sandviç yöntemidir.

Şırınga uygun bir çözücüyle temizlenirken (şırınganın iğnesinin içindeyken çözücü hala), şırınganın pompası şırıngaya az bir miktar hava girişi oluncaya kadar yukarı çekilir. Şırınga tüpünde görülecek şekilde hava çekilir. Sonra boş iğne örnek madde içine yerleştirilir. Şırınganın pompası arzu edilen madde hacmi boyunca çekilir. İğne örnek maddeye daldırıldığında, eğer 0.5 µL işaretliyse, istenen hacim 1.0 µL ise 1.5 µL işaretine kadar şırınga doldurulacak demektir. Sonra şırınga iğnesi hareket ettirilir. Ve yeni bir hava başlığı şırıngaya çekilir. Örnek maddeden hemen sonra olacak şekilde hava boşluğu şırıngada görülebilir olmalı. Sandviç yönteminin tamamlanmış hali; saf çözücü, hava, analit solüsyonu ve tekrar havadan oluşur. Şekil 4’ te gösterildiği gibidir. Enjeksiyon yapılırken hava boşluğu ve kısımlara ayrılma, erken buharlaşmadan dolayı iğne hala enjektördeyken ve şırınganın pompası itilmeden, oluşmayabilir. Çözücü ile madde arasındaki hava boşluğu karşıma riskini minimuma indirir ve iğnede madde kalmasını önlemeye yardımcı olur. Sonda bulunan bir miktar çözücü iğneyi herhangi bir madde solüsyonu kaldıysa temizler. Sandviç enjeksiyon tekniği çok modern GC otoörnekler metodunda kullanmaya elverişlidir.

Şekil 4. Örnek şırınga için sandviç tekniğinin şematik gösterimi. Örnek çözümün elikatı iki hava baloncuğu ile sıkıştırılır, saf çözücü de cila olarak bunu izler.

Unutulmaması gereken diğer önemli durum; maddenin tipi, çeşididir. Bu hangi enjeksiyon linerin yada kolon öncesi metodunun kullanılması mı gerektiğinin belirlenmesine yardımcı olur. Sandviç tekniği kullanılmadığında şırıngadaki pompa yavaşça hareket ettirilir. Bir miktar sıvı iğnenin ucunda alısı kalabilir. Sıcak enjeksiyon hacminde ve burada buharlaştırmak için çok uçucu bileşenler tercih edilebilir. Bununla beraber yüksek kaynama noktası olan maddeler solüsyonun içinde asılı bir damla olarak kalabilir ve bazıları seçilmiş hacimden enjeksiyon girişinden geri alınabilir. Bu yöntem yüksek kaynama noktası olan bileşenler için negatif bir etki yapabilir.

GC-MS analizlerinde enjeksiyon hızı sonuçların bulunmasında çok önemli bir faktördür. Şırınga pompasının maddeyi iğneye pompalayana kadar geçirdiği süre yada madde girdikten sonra iğnede kaldığı süre ve diğer faktörler sonuçların kalitesini etkileyebilir. Parçalı enjeksiyon mümkün olduğu kadar hızlı yapılabilir, bu bölünmeyi uzak tutabilir ve yüksek kaynama noktası olan bileşenlerin gereğinden fazla kaybına yol açabilir. Hızlı enjeksiyon teknikleri paketlenmiş kolonlarla sağlanabilir. Sıcak kolon üzerine enjeksiyon ve parçasız enjeksiyonları maddenin şırıngaya geri dönmesinden çekinilerek yavaşça yapılmalı. Sonuç itibarıyla düşük kaynama noktalı bileşenlerin kaybı olacaktır. Modern otoörnekler enjeksiyon hızı kontrolünü teklif eder.

Kapiler GC kolonlarında parçalı enjeksiyon yöntemi en kaliteli sonucu verir. Çünkü kolonun başında maddenin depolandığı ayrı bir hacim vardır, analitler ayrı bantlara ayrıştırılır, sonuçlar kromatografik uçlarda en iyi şekilde çözünmüşlerdir. Parçasız ve kolon üzeri teknikleri çözünen maddenin ilk kolon üzerine nispeten geniş segmentler olarak yayılmasına neden olur. Bu ayrışma eksikliği, kromatogramdaki uçların geniş olmasını ve düşük randımanlı ayrışmaya sebep olur.